Năm 2004, các hoạt động bí mật của Tập đoàn Umbrella tại thành phố Raccoon bị vỡ lở. Một cuộc điều tra được tiến hành bởi Chính quyền Liên bang Hoa Kỳ cho thấy nhiều nhân vật cấp cao trong Tập đoàn Umbrella có liên quan đến việc này. Chính quyền cho đóng cửa công ty và hoãn kinh doanh vô thời hạn, Tập đoàn Umbrella phá sản và sụp đổ.

Mật vụ Hoa Kỳ yêu cầu Leon S. Kennedy với một nhiệm vụ, đó là giải cứu Ashley Graham, con gái Tổng thống, người đã bị một giáo phái bí ẩn bắt cóc. Leon đến một ngôi làng xa xôi ở châu Âu, nơi đây anh chạm trán với những nhóm người nguyện chết cho Los Illuminados ("Những người được khai sáng" - tiếng Tây Ban Nha), giáo phái đã bắt cóc Ashley.

Khi ở trong làng, Leon đã chạm trán với tên trưởng làng, Bitores Mendez, và bị tiêm Las Plagas - một thứ ký sinh trùng có thể điều khiển lý trí con người. Anh bị trói cùng với Luis Sera, một nhà nghiên cứu từng làm việc cho Los Illuminados. Hai người cùng nhau trốn thoát, nhưng sau đó đi hai con đường khác nhau. Leon biết được rằng Ashley đang bị bắt giữ trong một nhà thờ, và cứu được cô ấy; và mặc dù Osmund Saddler, thủ lĩnh của Los Illuminados, đã tìm cách ngăn chặn hai người, họ đã thoát được.

Khi tiêu diệt được Mendez, Leon và Ashley tạm trú ẩn bên trong lâu đài của Ramon Salazar. Cho rằng nơi này sẽ an toàn để tránh Ganados, nhưng họ cũng mau chóng biết được rằng cả lâu đài và Salazar cũng đã bị nhiễm Las Plagas. Ashley bắt đầu ho ra máu, cho thấy rằng quả trứng Plagas trong người cô đã phát triển. Trong cơn hoảng loạn, Ashley chạy xa khỏi Leon, và hai người bị phân tán, mắc vào cái bẫy của Salazar. Leon và Sera gặp nhau vài lần trong trò chơi. Sera luôn xuất hiện và biến mất rất nhanh, lần đầu tiên để đưa thuốc cho Leon và Ashley để giảm tốc độ tiến triển, và lần sau đó để đưa một mẫu thử Plagas. Hai người gặp lại nhau trong lâu đài khi Leon đang tìm kiếm Ashley; lúc này Sera nói rằng anh đã có được mẫu thử, nhưng trước khi Sera kết thúc câu, Saddler đã giết anh và cướp luôn mẫu thử Plagas, ngay trước mặt Leon.

Khi Leon đã tìm thấy được Ashley, cô lại bị bắt cóc một lần nữa. Trong lâu đài, trong một thoáng Leon đã gặp lại Ada Wong. Sau đó, anh lục soát lâu đài để tìm Salazar, hắn đã nhập cơ thể hắn với một tay sai và sử dụng Las Plagas, làm cho cơ thể hắn càng lúc càng to lớn hơn. Hắn cố giết Leon nhưng cuối cùng chính hắn lại bị tiêu diệt. Leon biết được rằng lần này Ashley bị giam giữ ở một cơ sở nghiên cứu trên đảo gần đó, và anh lại gặp Ada, cô này đã đưa Leon đến hòn đảo. Jack Krauser, một trong những bằng hữu của Leon trong những năm huấn luyện, tưởng rằng đã chết, nay lại làm việc cho Saddler. Sau nhiều lần chạm trán với các thế lực của Saddler, Leon đã giải cứu được Ashley, tuy nhiên sau đó cô lại bị bắt cóc lần thứ ba.

Leon biết rằng Ada và Krauser đang cùng làm việc cho một tập đoàn thứ ba, và Krauser đã dự tính rằng sẽ giết Saddler khi hắn có cơ hội. Saddler biết việc này nên hắn đã yêu cầu Krauser giết Leon, không cần biết ai bị tiêu diệt, hắn đều có lợi. Sau cùng Leon cứu được Ashley, và họ đẩy Plagas ra khỏi cơ thể bằng một thiết bị xạ trị đặc biệt. Leon cho rằng mặc dù anh đã hoàn thành nhiệm vụ là giải cứu và chữa trị cho Ashley, đáng ra anh đã phải tiêu diệt Saddler. Với sự giúp đỡ của Ada, anh đã giết Saddler và lấy được mẫu Plagas. Tuy nhiên, Ada đã gí súng vào Leon, cướp được mẫu thử và rời đi bằng trực thăng. Leon và Ashley thoát khỏi hòn đảo bằng chiếc jet-ski của cô ta.